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細(xì)胞凋亡 (Apoptosis)

在細(xì)胞的“花樣”死亡方式一文中，小 M 已經(jīng)介紹過細(xì)胞的死亡方式有十幾種，凋亡只是其中一種：細(xì)胞凋亡 (Apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。

與被動的細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡是主動發(fā)生的，是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程，期間涉及一系列基因的靈活、表達(dá)以及調(diào)控等。

圖 1. 細(xì)胞凋亡的信號通路[1]

細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞皺縮、凋亡小體的形成等。

圖 2. 細(xì)胞凋亡過程

細(xì)胞凋亡的檢測

細(xì)胞凋亡，我們該如何檢測呢?

目前至少有數(shù)十種檢測細(xì)胞凋亡的方法，可以大致劃分為基于細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標(biāo)記三大類。

■ 基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法

1.1 電子顯微鏡檢測

電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞皺縮、凋亡小體的形成等。

圖 3. BBR 和 DDP 誘導(dǎo)下 OVCAR3 細(xì)胞的凋亡形態(tài)[2]

1.2 細(xì)胞核染色檢測

細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞膜通透性增強，染色質(zhì)發(fā)生固縮，故經(jīng) DAPI、Hoechst系列等熒光染料染色后可快速檢測細(xì)胞凋亡。除了實驗操作簡單、成本低廉之外，細(xì)胞核染色還可以定量。

圖 4. PC-3 細(xì)胞凋亡過程中核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化[3]

注：Hoechst 33342 染色觀察到核碎裂和核凝結(jié)。用 0、0.3、0.6、0.9 和 1.2 mg/mL 的莖提取物處理 PC-3 細(xì)胞 24h 后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞核形態(tài)變化。照片在 20× 熒光顯微鏡下拍攝。箭頭表示凋亡細(xì)胞。

■ 基于生物學(xué)功能的方法

2.1 線粒體膜電位的檢測

凋亡早期細(xì)胞，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位 (ΔΨm) 下降甚至消失。線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中近早發(fā)生的生物學(xué)變化。一旦線粒體膜電位被破壞，細(xì)胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。

目前常用一些親脂性陽離子染料如 JC-1 (HY-K0601) 檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位較高時，JC-1 在基質(zhì)中匯聚形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光 (Ex/Em=585/590 nm)；線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體基質(zhì)中，以單體形式存在產(chǎn)生綠色熒光 (Ex/Em=510/527 nm)。

圖 5. JC-1法檢測 KRA-533刺激下不同細(xì)胞的線粒體膜電位變化[4]

2.2 細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS) 位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)；細(xì)胞凋亡早期，PS 會外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。Annexin V (膜聯(lián)蛋白 V) 是一種 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與 PS 特異性結(jié)合，因此 Annexin V 常作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。Annexin V 經(jīng) FITC 標(biāo)記后可發(fā)綠色熒光。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色液是一種不能穿透細(xì)胞膜的紅色熒光染料，可對凋亡晚期細(xì)胞及壞死細(xì)胞染色。

經(jīng) Annexin V-FITC 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細(xì)胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。

圖 6. 不同濃度臭椿酮誘導(dǎo) A375 細(xì)胞的凋亡情況[5]

此外，除了用 FITC 標(biāo)記 Annexin V 之外，也可以用 EGFP、PE、mCherry 等作為熒光探針哦。

■ 基于生化標(biāo)記的方法

3.1 凋亡分子標(biāo)記檢測

Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases) 蛋白家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中具有重要的作用。絕大多數(shù)情況下，所有的凋亡信號都會匯集到凋亡的執(zhí)行者 Caspase-3 上。在正常細(xì)胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被靈活，并執(zhí)行過后的凋亡程序。因此可以通過檢測 Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來反應(yīng)細(xì)胞凋亡過程。此外，也可以通過檢測 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來檢測細(xì)胞凋亡。

圖 7. ZnO-NPs 誘導(dǎo)牙齦癌細(xì)胞的凋亡情況[6]

3.2 DNA 片段化檢測

在細(xì)胞凋亡的后期，Caspase 會靈活 Caspase-Activated DNase (CAD)，切割核小體之間的 DNA，形成以 180-200 bp 為單位的 DNA 片段，經(jīng)瓊脂糖電泳后形成 DNA ladder。

圖 8. DNA 片段化檢測 MCP30 誘導(dǎo)下 Ishikawa H 細(xì)胞的凋亡情況[7]

注：泳道 1-4 分別表示 0 pM、8.33 pM、333.33 pM 和 666.67 pM MCP30 誘導(dǎo) 72h 的 Ishikawa H 細(xì)胞

3.3 DNA 片段原位檢測 (TUNEL 法)

細(xì)胞凋亡時，相關(guān) DNA 內(nèi)切酶被靈活，進(jìn)而切斷核小體間的基因組 DNA，產(chǎn)生 180-200 bp 的 DNA ladder，暴露的 3’-OH 在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特異熒光探針標(biāo)記的 dUTP，借助熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀即可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖 9. TUNEL 法檢測苦參堿刺激下 HepG2 細(xì)胞凋亡情況[8]

看了這么多，相信大家對細(xì)胞凋亡的檢測方法都有了大概的了解。M** 現(xiàn)已推出細(xì)胞凋亡檢測相關(guān)試劑盒，心動不如行動，來 M** 官網(wǎng)查詢具體的產(chǎn)品信息吧！

相關(guān)產(chǎn)品

細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒

采用 Hoechst 33342 和碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 雙染的方法快速檢測細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死。

細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

采用碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 染色的方法檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 (Hoechst 法)

采用 Hoechst 33258 染色的方法快速檢測細(xì)胞凋亡。

Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

經(jīng) Annexin V-FITC 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細(xì)胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。

Annexin V-EGFP/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

Annexin V-EGFP 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細(xì)胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。與 FITC 相比，EGFP 的綠色熒光更強，不易淬滅，穩(wěn)定性更高。

線粒體膜電位檢測試劑盒 (JC-1)

一種以 JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測組織、細(xì)胞或純化的線粒體跨膜電勢差的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測。

參考文獻(xiàn)

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1. Wu J, Ye J, Kong W, et al. Programmed cell death pathways in hearing loss: A review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis. Cell Prolif. 2020, 53(11): e12915.

2. Liu L, Fan J, Ai G, et al. Berberine in combination with cisplatin induces necroptosis and apoptosis in ovarian cancer cells. Biol Res. 2019, 52(1): 37.

3. Chainumnim S, Saenkham A, Dolsophon K, et al. Stem Extract from Momordica cochinchinensis Induces Apoptosis in Chemoresistant Human Prostate Cancer Cells (PC-3). Molecules. 2022, 27(4): 1313.

4. Xu K, Park D, Magis AT, et al. Small Molecule KRAS Agonist for Mutant KRAS Cancer Therapy. Mol Cancer. 2019, 18(1): 85.

5. Liu W, Liu X, Pan Z, et al. Ailanthone Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Melanoma B16 and A375 Cells. Biomolecules. 2019, 9(7): 275.

6. L SW, Lee CH, Lin MS, et al. ZnO Nanoparticles Induced Caspase-Dependent Apoptosis in Gingival Squamous Cell Carcinoma through Mitochondrial Dysfunction and p70S6K Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2020, 21(5): 1612.

7. Gu HZ, Lin RR, Wang HC, et al. Effect of Momordica charantia protein on proliferation, apoptosis and the AKT signal transduction pathway in the human endometrial carcinoma Ishikawa H cell line in vitro. Oncol Lett. 2017, 13(5): 3032-3038.

8. Wei R, Cao J, Yao S. Matrine promotes liver cancer cell apoptosis by inhibiting mitophagy and PINK1/Parkin pathways. Cell Stress Chaperones. 2018, 23(6): 1295-1309.

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