今天我們要介紹幾種特殊的光學顯微鏡和不同光學顯微鏡之前的區(qū)別。
摘要
1.暗視野顯微鏡
2.體視顯微鏡
3.熒光顯微鏡
4.相差顯微鏡
5.倒置顯微鏡
6.偏光顯微鏡
1暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡不具備觀察物體內部的細微結構的功能,但可以分辨0.004μm以上的微粒的存在和運動。因而常用于觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。
暗視野顯微鏡的基本原理是丁達爾效應。當一束光線透過黑暗的房間,從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵“通路”,這種現(xiàn)象即丁達爾效應。
暗視野顯微鏡在普通的光學顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后,由于該聚光器內部拋物面結構的遮擋,照射在待檢物體表面的光線不能直接進入物鏡和目鏡,僅散射光能通過,因而視野是黑暗的。
暗視野顯微鏡的基本使用方法如下:
1.安裝暗視野聚光器(或用厚實的黑紙片制成遮光板,放在普通顯微鏡的聚光器下方,也能得到暗視野效果)。
2.選用強光源,一般用顯微鏡燈照明,以防止直射光線進入物鏡。
3.在聚光器和玻片之間加一滴香柏油,避免照明光線于聚光鏡上進行全反射,達不到被檢物體,而得不到暗視野照明。
4.進行中心調節(jié),即水平移動聚光器,使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。升降聚光器,將聚光鏡的焦點(圖1-2中圓錐光束的頂點)對準待檢物。
5.選用與聚光器相應的物鏡,調節(jié)焦距,按普通顯微鏡的方法操作。
2體視顯微鏡
體視顯微鏡又稱實體顯微鏡或解剖鏡,其成像為正立三維的空間影像,并具有立體感強、成像清晰寬闊、長工作距離(通常為110mm)以及連續(xù)放大觀看等特點。生物學上常用于解剖過程中的實時觀察
奧特光學SZ680/810體視顯微鏡
普通光學顯微鏡的光源為平行光,因而形成的是二維平面影像;而體視顯微鏡采用雙通道光路,雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角體視角(一般為12o15o),因而能形成三維空間的立體圖像。
體視顯微鏡與普通光學顯微鏡的使用方法相近,但更為便捷。二者的主要區(qū)別在于:
1.體視顯微鏡的鏡檢對象可不必制作成裝片。
2.體視顯微鏡載物臺直接固定在鏡座上,并配有黑白雙面板或玻璃板,操作者可根據(jù)鏡檢的對象和要求加以選擇。
3.體視顯微鏡的成像是正立的,便于解剖操作。
4.體視顯微鏡的物鏡僅一只,其放大倍數(shù)可通過旋轉調節(jié)螺旋連續(xù)調節(jié)。
3熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是利用細胞內物質發(fā)射的熒光強度對其進行定性和定量研究的一種光學工具。
細胞內的熒光物質物質有兩類,一類直接經(jīng)紫外線照射后即可發(fā)熒光,如葉綠素等;另有一些物質本身不具這一性質,但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色,經(jīng)紫外線照射后亦可發(fā)熒光
正置生物熒光顯微鏡/倒置生物熒光顯微鏡
熒光顯微鏡的原理為利用一個高發(fā)光效率的點光源(如超高壓汞燈),經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650λ或紫藍光4200λ)作為激發(fā)光,激發(fā)標本內的熒光物質發(fā)射出各色的熒光后,再通過物鏡后面的阻斷(或壓制)濾光片的過濾,后經(jīng)由目鏡的放大作用加以觀察。
阻斷濾光片的作用有二:一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛;二是選擇并讓特定的熒光透過,表現(xiàn)出專一的熒光色彩。
熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種:
1.透射式熒光顯微鏡
較為舊式的熒光顯微鏡,其激發(fā)光源通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強,而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱。所以它僅適用于觀察較大的標本材料。
2.落射式熒光顯微鏡
激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面,即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。
光路中需加上一個雙色束分離器(分色鏡),它與光軸呈45o角,激發(fā)光被反射到物鏡中,并聚集在樣品上,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡,返回到雙色束分離器,使激發(fā)光和熒光分開,殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊,可滿足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。
此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻,成像清晰,放大倍數(shù)愈大熒光愈強。
4相差顯微鏡
相差顯微鏡是能將光通過物體時產(chǎn)生的相位差(或光程差)轉變?yōu)檎穹?光強度)變化的顯微鏡。主要用于觀察活細胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標本。
人眼只能鑒別可見光的波長(顏色)和振幅的變化,不能鑒別相位的變化。而大多數(shù)生物標本高度透明,光波通過后振幅基本不變,僅存在相位的變化。
相差顯微鏡基本把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差。
從結構上看,相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處在于:
1.環(huán)形光闌具有環(huán)形開孔的光闌,安裝在光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,聚焦到標本上。
2.相位板相差顯微鏡在物鏡內部增加了涂有氟化鎂的相位板,作用是將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。相板上有兩個區(qū)域,直射光通過的部分叫“共軛面”,衍射光通過的部分叫“補償面”。相位板按工作效果分為兩種類型:
(1)A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波疊加,振幅加大,標本結構比周圍介質更加明亮,形成亮反差(或稱負反差)。
(2)B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,標本結構比周圍介質更加暗淡,形成暗反差(或稱正反差)。帶有相板的物鏡叫相差物鏡,常在物鏡外殼上以“Ph”字樣。
合軸調節(jié)望遠鏡
相差顯微鏡配備有一個合軸調節(jié)望遠鏡(在外殼上標有“CT”符號),用于調節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合,以便實現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。
使用時撥去一側目鏡,插入合軸調節(jié)望遠鏡,調節(jié)合軸調節(jié)望遠鏡的焦點,視野中會呈現(xiàn)兩個圓環(huán),分別是明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與較暗的相板上共軛面圓環(huán)。再轉動聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個調節(jié)螺旋,使兩環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過小或過大,可調節(jié)聚光器的升降旋鈕,使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到高點或降到低點而仍不能矯正,說明玻片太厚了,應更換。調好后即可取下合軸調節(jié)望遠鏡,換回目鏡。
綠色濾光片
用于調整光源的波長。照明光線的波長不同,會引起相位的變化,為了獲得良好的相差效果,相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光,通常是用綠色濾光片來調整。
相差顯微鏡的使用步驟如下:
?、俑鶕?jù)待檢標本的性質及要求,挑選適合的相差物鏡。
?、趯吮静F诺捷d物臺上,進行光軸中心的調整。
?、凼褂煤陷S調節(jié)望遠鏡,調整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合后,換回目鏡。在觀察過程中,每次更換物鏡倍數(shù)時,必須重新進行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調整。
?、芗泳G色濾光片,按普通光學顯微鏡的操作步驟進行觀察。
5倒置顯微鏡
倒置顯微鏡的結構和普通顯微鏡基本相同,只不過物鏡與照明系統(tǒng)位置交換,前者在載物臺之下,后者在載物臺之上。主要用于觀察培養(yǎng)的活細胞,需配制相差物鏡。
奧特光學BDS500倒置生物顯微鏡
6偏光顯微鏡
偏光顯微鏡可用于檢測具有雙折射性的物質,如染色體、膠原、纖維絲等。
奧特光學BK-POL投射偏光顯微鏡
奧特光學BK-POL透反射偏光顯微鏡
和普通顯微鏡不同的是:
①偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡(起偏器),使進入顯微鏡的光線為偏振光。
②鏡筒中有檢偏振鏡(檢偏器,一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器)。
③使用旋轉載物臺。當載物臺上放入單折射的物質時,無論如何旋轉載物臺,由于兩個偏振片是垂直的,顯微鏡里看不到光線,而放入雙折射性物質時,由于光線通過這類物質時發(fā)生偏轉,因此旋轉載物臺便能檢測到這種物體。
④配備補償器或相位片;
?、菔褂脽o應力物鏡。