激光掃描共聚焦熒光顯微鏡是一種利用計(jì)算機(jī)、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、目前較先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器。主要用于觀察活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化,定量分析,以及實(shí)時(shí)定量測定等。
激光共聚焦顯微鏡原理:利用放置在光 源后的照明針孔,和放置在檢測器前的探測針孔,實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測。來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上,該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上,該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的,因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn),被探測點(diǎn)所在的平面即共焦平面。
計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上,為了產(chǎn)生一幅完整的圖像,由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描,從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng),將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上,樣品的新層面又成像在顯示器上,隨著Z軸的不斷移動(dòng),就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。
與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的區(qū)別
傳統(tǒng)熒光顯微鏡有一個(gè)難以克服的缺點(diǎn):焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛。原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是重疊結(jié)構(gòu),假若熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在不同層次上都有分布,且重疊,來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡所接收,熒光顯微鏡的分辨率就要大大降低。
在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上,激光掃描共聚焦顯微鏡用激光作為光源,采用共軛聚焦原理和裝置,并利用計(jì)算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察、分析和輸出??梢詫悠愤M(jìn)行斷層掃描和成像,進(jìn)行無損傷觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。同時(shí),利用免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記探針,該技術(shù)不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片,還可以對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子及生命活動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察和檢測,在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+,pH值,膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化,成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。