來源：教育裝備采購網(wǎng) 作者：MedChemExpress 責任編輯：張肖
在細胞的“花樣”死亡方式一文中，小 M 已經(jīng)介紹過細胞的死亡方式有十幾種，凋亡只是其中一種：細胞凋亡 (Apoptosis)，又稱程序性細胞死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。
與被動的細胞壞死不同，細胞凋亡是主動發(fā)生的，是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程，期間涉及一系列基因的靈活、表達以及調(diào)控等。
圖 1. 細胞凋亡的信號通路[1]
細胞凋亡的主要形態(tài)學特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細胞膜起泡、細胞皺縮、凋亡小體的形成等。
圖 2. 細胞凋亡過程
細胞凋亡的檢測
細胞凋亡，我們該如何檢測呢?目前至少有數(shù)十種檢測細胞凋亡的方法，可以大致劃分為基于細胞形態(tài)、生物學功能和生化標記三大類。
■ 基于細胞形態(tài)學的方法
1.1 電子顯微鏡檢測
電鏡形態(tài)學觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。細胞凋亡的主要形態(tài)學特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA 片段化、細胞膜起泡、細胞皺縮、凋亡小體的形成等。
圖 3. BBR 和 DDP 誘導下 OVCAR3 細胞的凋亡形態(tài)[2]
1.2 細胞核染色檢測
細胞凋亡時，細胞膜通透性增強，染色質(zhì)發(fā)生固縮，故經(jīng) DAPI、Hoechst系列等熒光染料染色后可快速檢測細胞凋亡。除了實驗操作簡單、成本低廉之外，細胞核染色還可以定量。
圖 4. PC-3 細胞凋亡過程中核染色質(zhì)的形態(tài)學變化[3]
注：Hoechst 33342 染色觀察到核碎裂和核凝結。用 0、0.3、0.6、0.9 和 1.2 mg/mL 的莖提取物處理 PC-3 細胞 24h 后，細胞出現(xiàn)典型的凋亡細胞核形態(tài)變化。照片在 20× 熒光顯微鏡下拍攝。箭頭表示凋亡細胞。
■ 基于生物學功能的方法
2.1 線粒體膜電位的檢測
凋亡早期細胞，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位 (ΔΨm) 下降甚至消失。線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡過程中近早發(fā)生的生物學變化。一旦線粒體膜電位被破壞，細胞凋亡將不可逆轉。
目前常用一些親脂性陽離子染料如 JC-1 (HY-K0601) 檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位較高時，JC-1 在基質(zhì)中匯聚形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光 (Ex/Em=585/590 nm)；線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體基質(zhì)中，以單體形式存在產(chǎn)生綠色熒光 (Ex/Em=510/527 nm)。
圖 5. JC-1法檢測 KRA-533刺激下不同細胞的線粒體膜電位變化[4]
2.2 細胞膜表面磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測
在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS) 位于細胞膜內(nèi)側；細胞凋亡早期，PS 會外翻到細胞膜外側。Annexin V (膜聯(lián)蛋白 V) 是一種 Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，可與 PS 特異性結合，因此 Annexin V 常作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。Annexin V 經(jīng) FITC 標記后可發(fā)綠色熒光。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色液是一種不能穿透細胞膜的紅色熒光染料，可對凋亡晚期細胞及壞死細胞染色。
經(jīng) Annexin V-FITC 和 PI 聯(lián)合染色后，正常細胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。
圖 6. 不同濃度臭椿酮誘導 A375 細胞的凋亡情況[5]
此外，除了用 FITC 標記 Annexin V 之外，也可以用 EGFP、PE、mCherry 等作為熒光探針哦。
■ 基于生化標記的方法
3.1 凋亡分子標記檢測
Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases) 蛋白家族在介導細胞凋亡過程中具有重要的作用。絕大多數(shù)情況下，所有的凋亡信號都會匯集到凋亡的執(zhí)行者 Caspase-3 上。在正常細胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被靈活，并執(zhí)行過后的凋亡程序。因此可以通過檢測 Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來反應細胞凋亡過程。此外，也可以通過檢測 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來檢測細胞凋亡。
圖 7. ZnO-NPs 誘導牙齦癌細胞的凋亡情況[6]
3.2 DNA 片段化檢測
在細胞凋亡的后期，Caspase 會靈活 Caspase-Activated DNase (CAD)，切割核小體之間的 DNA，形成以 180-200 bp 為單位的 DNA 片段，經(jīng)瓊脂糖電泳后形成 DNA ladder。
圖 8. DNA 片段化檢測 MCP30 誘導下 Ishikawa H 細胞的凋亡情況[7]
注：泳道 1-4 分別表示 0 pM、8.33 pM、333.33 pM 和 666.67 pM MCP30 誘導 72h 的 Ishikawa H 細胞
3.3 DNA 片段原位檢測 (TUNEL 法)
細胞凋亡時，相關 DNA 內(nèi)切酶被靈活，進而切斷核小體間的基因組 DNA，產(chǎn)生 180-200 bp 的 DNA ladder，暴露的 3’-OH 在末端脫氧核苷酸轉移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特異熒光探針標記的 dUTP，借助熒光顯微鏡或流式細胞儀即可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
圖 9. TUNEL 法檢測苦參堿刺激下 HepG2 細胞凋亡情況[8]
看了這么多，相信大家對細胞凋亡的檢測方法都有了大概的了解。
參考文獻
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3. Chainumnim S, Saenkham A, Dolsophon K, et al. Stem Extract from Momordica cochinchinensis Induces Apoptosis in Chemoresistant Human Prostate Cancer Cells (PC-3). Molecules. 2022, 27(4): 1313.
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6. L SW, Lee CH, Lin MS, et al. ZnO Nanoparticles Induced Caspase-Dependent Apoptosis in Gingival Squamous Cell Carcinoma through Mitochondrial Dysfunction and p70S6K Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2020, 21(5): 1612.
7. Gu HZ, Lin RR, Wang HC, et al. Effect of Momordica charantia protein on proliferation, apoptosis and the AKT signal transduction pathway in the human endometrial carcinoma Ishikawa H cell line in vitro. Oncol Lett. 2017, 13(5): 3032-3038.
8. Wei R, Cao J, Yao S. Matrine promotes liver cancer cell apoptosis by inhibiting mitophagy and PINK1/Parkin pathways. Cell Stress Chaperones. 2018, 23(6): 1295-1309.
