很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都要檢測(cè)熒光,為方便大家選擇合適的方法,在此簡(jiǎn)單說(shuō)一下各種熒光檢測(cè)方法的特點(diǎn)。不足的地方,歡迎大家補(bǔ)充:
1、流式,優(yōu)點(diǎn)是速度快,非常適合做大數(shù)量統(tǒng)計(jì),且樣品只被檢測(cè)一次,完全不用擔(dān)心熒光淬滅的問(wèn)題。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)熒光的有無(wú)、強(qiáng)度大小,無(wú)法提供空間定位信息,無(wú)法做熒光定位變化的實(shí)驗(yàn);由于樣品只被檢測(cè)一次,因此無(wú)法對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)觀察。例如,做膜蛋白定位時(shí)會(huì)得到這么一個(gè)結(jié)果——用流式可以檢測(cè)出信號(hào),但是用顯微鏡卻看不到東西,排除儀器和濾光片選擇問(wèn)題,很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標(biāo)記造成流式的假陽(yáng)性結(jié)果。
2、熒光顯微鏡,剛好與流式互補(bǔ),可很好地進(jìn)行空間觀察,判斷目標(biāo)蛋白的定位,但是不適合做大流量檢測(cè),估計(jì)沒(méi)人能經(jīng)得起時(shí)間的考驗(yàn)。有不同倍率的物鏡選擇,可以使用高倍物鏡看精細(xì)結(jié)構(gòu),或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計(jì)。與之搭配的CCD和軟件,是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵。尤其是CCD,從那么多商品里選一款合適的不容易,需要了解很多知識(shí)否則只能聽(tīng)別人忽悠。
3、共聚焦,熒光顯微鏡的升級(jí)產(chǎn)品,具有很好的光學(xué)層切效果,能得到很好三維定位信息。但是,如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照,取得一張好看的圖片,就讓人覺(jué)得可惜了。共聚焦基本都是全自動(dòng)系統(tǒng),可隨意定義照明區(qū)域、選擇多個(gè)熒光通路和設(shè)定定時(shí)取圖,所以,做Time-laps、FRAP和FRET有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。另外,4Pi和
STED又是其中的**,具有超高的空間分辨率,只是使用不方便,未必適合做生物實(shí)驗(yàn)。
4、全內(nèi)反射,熒光顯微鏡的另一種升級(jí)產(chǎn)品,屬于近場(chǎng)光學(xué)范疇,只適合且*適合做膜研究,無(wú)法看到胞內(nèi)信息。也是用CCD成像,但是對(duì)CCD的要求更高——個(gè)人甚至覺(jué)得對(duì)CCD的要求是沒(méi)有上限的。
5、雙光子,另一種共聚焦,因使用長(zhǎng)波激發(fā)熒光,故能做深層檢測(cè)(突破共聚焦的100微米極限),*典型的應(yīng)用是觀察活體腦組織。巨貴無(wú)比,國(guó)內(nèi)沒(méi)有幾臺(tái),能用上的人不多——就不說(shuō)了。
6、新推出的高內(nèi)涵藥篩系統(tǒng),流式和顯微鏡的雜合體,使用電動(dòng)載物臺(tái),可以自動(dòng)地按預(yù)定程序完成實(shí)驗(yàn),可做大流量檢測(cè)(雖然速度慢點(diǎn)),而且有成像能力,可以判斷定位。前段時(shí)間,國(guó)內(nèi)哪裝了**臺(tái),很多人在吹,但我實(shí)在不知道其中的好處——任何一臺(tái)帶電動(dòng)載物臺(tái)的顯微鏡都可以達(dá)到相似的效果,只要軟件支持——估計(jì)有人賺大發(fā)啦!
從以上的簡(jiǎn)介可以看出,只要是熒光樣品,就應(yīng)該都可使用以上儀器檢測(cè)(只用TIRF受一些限制)。但是實(shí)際應(yīng)用時(shí),大家可能會(huì)碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡,但是無(wú)法使用共聚焦。為什么?解釋一下:
首先,熒光檢測(cè)必須有激發(fā)光照明,染料被特定波長(zhǎng)的光照射以后才能發(fā)射熒光。激發(fā)光源有兩種:1)白光(汞燈、氙燈等),然后通過(guò)濾光片選擇只通過(guò)特定波長(zhǎng)的光。如檢測(cè)GFP時(shí),大家能看到藍(lán)光照射在樣品上,因?yàn)镚FP的激發(fā)條件是488nm
光。但是有一點(diǎn),顯微鏡不可能裝無(wú)限多的濾光片,所以選擇是有限的。2)激光,普通的激光器 只能發(fā)射特定波長(zhǎng)的光,且數(shù)量有限,常見(jiàn)的是405、488、
514、543、633等,所以可使用的染料也是有限。因此,大家判定儀器能否滿足你實(shí)驗(yàn)要求,務(wù)必先看看激發(fā)條件是否合適。
其次,在光檢測(cè)器(PMT、CCD)前還有一塊濾光片,作用是反射樣品各種散射光,只通過(guò)特定波長(zhǎng)的熒光,提高信噪比,得到干凈的背景。因此,這塊濾光片也決定了儀器能否滿足你的實(shí)驗(yàn)要求(不用太擔(dān)心,這個(gè)一般和激發(fā)濾光片配套,不會(huì)有太多問(wèn)題)。而在光譜型共聚焦里,使用的是棱鏡或衍射光柵分光,可以選擇通過(guò)任意需要的波段。這對(duì)使用量子點(diǎn)做標(biāo)記的同學(xué)特別有好處。