顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器,已有300多年的發(fā)展史。自從有了顯微鏡,人們看到了過去看不到的許多微小生物和構(gòu)成生物的基本單元——細(xì)胞。目前,不僅有能放大千余倍的光學(xué)顯微鏡,而且有放大幾十萬倍的電子顯微鏡,使我們對生物體的生命活動(dòng)規(guī)律有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。在普通中學(xué)生物教學(xué)大綱中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)中,大部分要通過顯微鏡來完成,因此,顯微鏡性能的好壞是做好觀察實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。
一、顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)
顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡、反光鏡和聚光器四個(gè)部件。廣義的說也包括照明光源、濾光器、蓋玻片和載玻片等。
?。ㄒ唬⑽镧R
物鏡是決定顯微鏡性能的zui重要部件,安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上,接近被觀察的物體,故叫做物鏡或接物鏡。
1、物鏡的分類
物鏡根據(jù)使用條件的不同可分為干燥物鏡和浸液物鏡;其中浸液物鏡又可分為水浸物鏡和油浸物鏡(常用放大倍數(shù)為90—100倍)。
根據(jù)放大倍數(shù)的不同可分為 低倍物鏡(10倍以下)、中倍物鏡(20倍左右)高倍物鏡(40—65倍)。
根據(jù)像差矯正情況,分為消色差物鏡(常用,能矯正光譜中兩種色光的色差的物鏡)和復(fù)色差物鏡(能矯正光譜中三種色光的色差的物鏡,價(jià)格貴,使用少)。
2、物鏡的主要參數(shù):
物鏡主要參數(shù)包括:放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。
?、佟⒎糯蟊稊?shù)是指眼睛看到像的大小與對應(yīng)標(biāo)本大小的比值。它指的是長度的比值而不是面積的比值。例:放大倍數(shù)為100×,指的是長度是1μm的標(biāo)本,放大后像的長度是100μm,要是以面積計(jì)算,則放大了10,000倍。
顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。
②、數(shù)值孔徑也叫鏡口率,簡寫NA 或A,是物鏡和聚光器的主要參數(shù),與顯微鏡的分辨力成正比。干燥物鏡的數(shù)值孔徑為0.05-0.95,油浸物鏡(香柏油)的數(shù)值孔徑為1.25。
?、?、工作距離是指當(dāng)所觀察的標(biāo)本zui清楚時(shí)物鏡的前端透鏡下面到標(biāo)本的蓋玻片上面的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關(guān),物鏡的焦距越長,放大倍數(shù)越低,其工作距離越長。例:10倍物鏡上標(biāo)有10/0.25和160/0.17,其中10為物鏡的放大倍數(shù);0.25為數(shù)值孔徑;160為鏡筒長度(單位mm);0.17為蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度(單位 mm)。10倍物鏡有效工作距離為6.5mm,40倍物鏡有效工作距離為0.48mm 。
3、物鏡的作用是將標(biāo)本作次放大,它是決定顯微鏡性能的zui重要的部件——分辨力的高低。
分辨力也叫分辨率或分辨本領(lǐng)。分辨力的大小是用分辨距離(所能分辨開的兩個(gè)物點(diǎn)間的zui小距離)的數(shù)值來表示的。在明視距離(25cm)之處,正常人眼所能看清相距0.073mm的兩個(gè)物點(diǎn),這個(gè)0.073mm的數(shù)值,即為正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨距離越小,即表示它的分辨力越高,也就是表示它的性能越好。
顯微鏡的分辨力的大小由物鏡的分辨力來決定的,而物鏡的分辨力又是由它的數(shù)值孔徑和照明光線的波長決定的。
當(dāng)用普通的中央照明法(使光線均勻地透過標(biāo)本的明視照明法)時(shí),顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA
式中d——物鏡的分辨距離,單位 nm。
λ——照明光線波長,單位 nm。
NA ——物鏡的數(shù)值孔徑
例如油浸物鏡的數(shù)值孔徑為1.25,可見光波長范圍為400—700nm ,取其平均波長550 nm,則d=270 nm,約等于照明光線波長一半。一般地,用可見光照明的顯微鏡分辨力的極限是0.2μm。
?。ǘ?、目鏡
因?yàn)樗拷^察者的眼睛,因此也叫接目鏡。安裝在鏡筒的上端。
1、目鏡的結(jié)構(gòu)
通常目鏡由上下兩組透鏡組成,上面的透鏡叫做接目透鏡,下面的透鏡叫做會(huì)聚透鏡或場鏡。上下透鏡之間或場鏡下面裝有一個(gè)光闌(它的大小決定了視場的大小),因?yàn)闃?biāo)本正好在光闌面上成像,可在這個(gè)光闌上粘一小段毛發(fā)作為指針,用來指示某個(gè)特點(diǎn)的目標(biāo)。也可在其上面放置目鏡測微尺,用來測量所觀察標(biāo)本的大小。
目鏡的長度越短,放大倍數(shù)越大(因目鏡的放大倍數(shù)與目鏡的焦距成反比)。
2、目鏡的作用
是將已被物鏡放大的,分辨清晰的實(shí)像進(jìn)一步放大,達(dá)到人眼能容易分辨清楚的程度。
常用目鏡的放大倍數(shù)為5—16倍。
3、目鏡與物鏡的關(guān)系
物鏡已經(jīng)分辨清楚的細(xì)微結(jié)構(gòu),假如沒有經(jīng)過目鏡的再放大,達(dá)不到人眼所能分辨的大小,那就看不清楚;但物鏡所不能分辨的細(xì)微結(jié)構(gòu),雖然經(jīng)過高倍目鏡的再放大,也還是看不清楚,所以目鏡只能起放大作用,不會(huì)提高顯微鏡的分辨率。有時(shí)雖然物鏡能分辨開兩個(gè)靠得很近的物點(diǎn),但由于這兩個(gè)物點(diǎn)的像的距離小于眼睛的分辨距離,還是無法看清。所以,目鏡和物鏡即相互聯(lián)系,又彼此制約。
?。ㄈ?、聚光器
聚光器也叫集光器。位于標(biāo)本下方的聚光器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中,聚光鏡可分為明視場聚光鏡(普通顯微鏡配置)和暗視場聚光鏡。
1、光鏡的主要參數(shù)
數(shù)值孔徑(NA )是聚光鏡的主要參數(shù),zui大數(shù)值孔徑一般是1.2—1.4,數(shù)值孔徑有一定的可變范圍,通??淘谏戏酵哥R邊框上的數(shù)字是代表zui大的數(shù)值孔徑,通過調(diào)節(jié)下部可變光闌的開放程度,可得到此數(shù)字以下的各種不同的數(shù)值孔徑,以適應(yīng)不同物鏡的需要。有的聚光鏡由幾組透鏡組成,zui上面的一組透鏡可以卸掉或移出光路,使聚光鏡的數(shù)值孔徑變小,以適應(yīng)低倍物鏡觀察時(shí)的照明。
2、聚光鏡的作用
聚光鏡的作用相當(dāng)于凸透鏡,起會(huì)聚光線的作用,以增強(qiáng)標(biāo)本的照明。一般地把聚光鏡的聚光焦點(diǎn)設(shè)計(jì)在它上端透鏡平面上方約1.25mm處。(聚光焦點(diǎn)正在所要觀察的標(biāo)本上,載玻片的厚度為1.1mm左右)
3、可變光闌
可變光闌也叫光圈,位于聚光鏡的下方,由十幾張金屬薄片組成,中心部分形成圓孔。其作用是調(diào)節(jié)光強(qiáng)度和使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應(yīng)。可變光闌開得越大,數(shù)值孔徑越大(觀察完畢后,應(yīng)將光圈調(diào)至zui大)。
在可變光闌下面,還有一個(gè)圓形的濾光片托架。
說明:在中學(xué)實(shí)驗(yàn)室只有教師用顯微鏡(1600×或1500×)才配有聚光器,學(xué)生用顯微鏡(640×或500×)配的是旋轉(zhuǎn)光欄。緊貼在載物臺下,能做圓周轉(zhuǎn)動(dòng)的圓盤,旋轉(zhuǎn)光欄(也稱為遮光器),光欄上有大小不等的圓孔,叫光圈。直徑分別為2、3、6、12、16mm,轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)光欄,光欄上每個(gè)光圈都可以對正通光孔,通過大小不等的光圈來調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。
(四)反光鏡
反光鏡是一個(gè)可以隨意轉(zhuǎn)動(dòng)的雙面鏡,直徑為50mm,一面為平面,一面為凹面,其作用是將從任何方向射來的光線經(jīng)通光孔反射上來。平面鏡反射光線的能力較弱,是在光線較強(qiáng)時(shí)使用,凹面鏡反射光線的能力較強(qiáng),是在光線較弱時(shí)使用。
反光鏡通常一面是平面鏡,另一面是凹面鏡,裝在聚光器下面,可以在水平與垂直兩個(gè)方向上任意旋轉(zhuǎn)。
反光鏡的作用是使由光源發(fā)出的光線或天然光射向聚光器。當(dāng)用聚光器時(shí)一般用平面鏡,不用時(shí)用凹面鏡;當(dāng)光線強(qiáng)時(shí)用平面鏡,弱時(shí)用凹面鏡。
觀察完畢后,應(yīng)將反光鏡垂直放置。
(五)照明光源
顯微鏡的照明可以用天然光源或人工光源
1、天然光源
光線來自天空,zui好是由白云反射來的。不可利用直接照來的太陽光。
2、人工光源
?、?、對人工光源的基本要求:有足夠的發(fā)光強(qiáng)度;光源發(fā)熱不能過多。
?、?、常用的人工光源:顯微鏡燈;日光燈
?。V光器
安裝在光源和聚光器之間。作用是讓所選擇的某一波段的光線通過,而吸收掉其他的光線,即為了改變光線的光譜成分或削弱光的強(qiáng)度。分為兩大類:濾光片和液體濾光器。
(七)蓋玻片和載玻片
蓋玻片和載玻片的表面應(yīng)相當(dāng)平坦,無氣泡,無劃痕。zui好選用無色,透明度好的,使用前應(yīng)洗凈。
蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是0.17±0.02mm,如不用蓋玻片或蓋玻片厚度不合適,都回影響成像質(zhì)量。
載玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是1.1±0.04mm,一般可用范圍是1—1.2mm,若太厚會(huì)影響聚光器效能,太薄則容易破裂。
二、顯微鏡的機(jī)械裝置
顯微鏡的機(jī)械裝置是顯微鏡的重要組成部分。其作用是固定與調(diào)節(jié)光學(xué)鏡頭,固定與移動(dòng)標(biāo)本等。主要有鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、與調(diào)焦裝置組成。
(一)、鏡座和鏡臂
1、鏡座 作用是支撐整個(gè)顯微鏡,裝有反光鏡,有的還裝有照明光源。
2、鏡臂 作用是支撐鏡筒和載物臺。分固定、可傾斜兩種。
?。ǘ?、載物臺(又稱工作臺、鏡臺)
載物臺作用是安放載玻片,形狀有圓形和方形兩種,其中方形的面積為120mm×110mm。中心有一個(gè)通光孔,通光孔后方左右兩側(cè)各有一個(gè)安裝壓片夾用的小孔。分為固定式與移動(dòng)式兩種。有的載物臺的縱橫坐標(biāo)上都裝有游標(biāo)尺,一般讀數(shù)為0.1mm,游標(biāo)尺可用來測定標(biāo)本的大小,也可用來對被檢部分做標(biāo)記。
?。ㄈ㈢R筒
鏡筒上端放置目鏡,下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器。分為固定式和可調(diào)節(jié)式兩種。機(jī)械筒長(從目鏡管上緣到物鏡轉(zhuǎn)換器螺旋口下端的距離稱為鏡筒長度或機(jī)械筒長)不能變更的叫做固定式鏡筒,能變更的叫做調(diào)節(jié)式鏡筒,新式顯微鏡大多采用固定式鏡筒,國產(chǎn)顯微鏡也大多采用固定式鏡筒,國產(chǎn)顯微鏡的機(jī)械筒長通常是160mm。
安裝目鏡的鏡筒,有單筒和雙筒兩種。單筒又可分為直立式和傾斜式兩種,雙筒則都是傾斜式的。其中雙筒顯微鏡,兩眼可同時(shí)觀察以減輕眼睛的疲勞。雙筒之間的距離可以調(diào)節(jié),而且其中有一個(gè)目鏡有屈光度調(diào)節(jié)(即視力調(diào)節(jié))裝置,便于兩眼視力不同的觀察者使用。
?。ㄋ模?、物鏡轉(zhuǎn)換器
物鏡轉(zhuǎn)換器固定在鏡筒下端,有3—4個(gè)物鏡螺旋口,物鏡應(yīng)按放大倍數(shù)高低順序排列。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器時(shí),應(yīng)用手指捏住旋轉(zhuǎn)碟旋轉(zhuǎn),不要用手指推動(dòng)物鏡,因時(shí)間長容易使光軸歪斜,使成像質(zhì)量邊壞。
?。ㄎ澹?、調(diào)焦裝置
顯微鏡上裝有粗準(zhǔn)焦螺旋和細(xì)準(zhǔn)焦螺旋。有的顯微鏡粗準(zhǔn)焦螺旋與裝在同一軸上,大螺旋為粗準(zhǔn)焦螺旋,小螺旋為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋;有的則分開安置,位于鏡臂的上端較大的一對螺旋為是粗準(zhǔn)焦螺旋,其轉(zhuǎn)動(dòng)一周,鏡筒上升或下降10mm。 位于粗準(zhǔn)焦螺旋下方較小的一對螺旋為細(xì)準(zhǔn)焦螺旋,其轉(zhuǎn)動(dòng)一周,鏡筒升降值為0.1mm,細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)焦范圍不小于1.8mm。
三、顯微鏡及其部件的使用
1、使用單筒顯微鏡時(shí),要養(yǎng)成用左眼觀察的習(xí)慣(因一般用右手畫圖),觀察時(shí)要兩眼同時(shí)睜開,不要睜一只閉一只,因?yàn)檫@樣易于疲勞。為了訓(xùn)練學(xué)生習(xí)慣于兩眼同時(shí)睜開觀察,可剪一塊長約14cm,寬約6cm的長方形硬紙片,在靠近左端處挖一個(gè)直徑比鏡筒上端外徑略小的圓孔,把圓孔套在鏡筒上段,觀察時(shí)兩眼同時(shí)睜開,利用紙片的右端擋住右眼的視線,這樣訓(xùn)練一段時(shí)間后,就能習(xí)慣于兩眼同時(shí)睜開,然后把紙片去掉。
2、直筒顯微鏡的鏡臂與鏡座連接處,是一個(gè)機(jī)械關(guān)節(jié),可用于調(diào)節(jié)鏡筒的傾斜度,便于觀察,鏡臂不能過于后傾,一般不超過40°。但是在使用臨時(shí)裝片觀察時(shí),禁止使用傾斜關(guān)節(jié)(當(dāng)鏡筒傾斜時(shí),載物臺也隨之傾斜,載玻片上的液體易流出),尤其是裝片內(nèi)含酸性試劑時(shí)嚴(yán)禁使用,以免污損鏡體。
3、目鏡和物鏡的使用
一般都是用一個(gè)放大倍數(shù)適中的目鏡(10×)和zui低倍的物鏡開始觀察,逐步改用倍數(shù)較高的物鏡,從中找到符合實(shí)驗(yàn)要求的放大倍數(shù)。
轉(zhuǎn)換物鏡時(shí),先用低倍鏡觀察,調(diào)節(jié)到正確的工作距離(成像zui清晰)。如果進(jìn)一步使用高倍物鏡觀察,應(yīng)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前,把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央(將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時(shí),視野中的物像范圍縮小了很多)。低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦(同高調(diào)焦),在用低倍物鏡觀察清晰時(shí),換高倍物鏡應(yīng)可以見到物像,但物像不一定很清晰,可以轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋進(jìn)行調(diào)節(jié)。
通常認(rèn)為,使用任何一個(gè)物鏡時(shí),有效放大倍數(shù)的上限是1,000乘它的數(shù)值孔徑,下限是250乘它的數(shù)值孔徑。如40×物鏡的數(shù)值孔徑是0.65,則上、下限分別為:1000×0.65=650倍和250×0.65≈163倍,超過有效放大倍數(shù)上限的叫做無效放大,不能提高觀察效果。低于下限的放大倍數(shù)則人眼無法分辨,不利于觀察。一般zui實(shí)用的放大倍數(shù)范圍是500—700乘數(shù)值孔徑之間的數(shù)字。
4、油浸物鏡的使用
使用油浸物鏡時(shí),一般不要使用同高調(diào)焦。同高調(diào)焦只適用于每臺顯微鏡的原配物鏡,在使用低倍和高倍物鏡時(shí),是一個(gè)極有利的方便條件,但在使用油浸物鏡時(shí),則受到一定限制,一般地說,用油鏡觀察未加蓋玻片的標(biāo)本片(載玻片)時(shí),利用同高調(diào)焦的安全度較大,而對于有蓋玻片的標(biāo)本片,要小心使用,因?yàn)橛徒镧R的工作距離很短,在設(shè)計(jì)和裝配時(shí)所考慮的同高是對標(biāo)準(zhǔn)厚度蓋玻片的。
用油浸物鏡時(shí),只在標(biāo)本片上滴香柏油。觀察完畢后,要及時(shí)進(jìn)行清潔工作,如不及時(shí)進(jìn)行,香柏油粘上灰塵,擦拭時(shí)灰塵粒子可能磨損透鏡,香柏油在空氣中暴露時(shí)間長,還會(huì)變稠、變干,擦拭很困難,對儀器很不利。擦拭要細(xì)心,動(dòng)作要輕。油浸物鏡前端先用干的擦鏡紙擦一兩次,把大部分油去掉,再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦兩次,zui后再用干的擦鏡紙擦一次。標(biāo)本片上的香柏油可用“拉紙法”(即把一小張擦鏡紙蓋在香柏油上,然后在紙上滴一些二甲苯,趁濕把紙往外拉,這樣連續(xù)三四次,即可干凈,一般不會(huì)損壞未加蓋玻片的涂片標(biāo)本)擦凈。擦鏡紙也要防塵,一般在使用前,將每頁剪成8小塊,貯存在一個(gè)干凈的小培養(yǎng)皿中,用起來既節(jié)省又方便。
5、聚光器的使用方法
?、?、使用聚光器的原因
當(dāng)放大倍數(shù)增加時(shí),一方面由于放大倍數(shù)越高,透鏡數(shù)目越多,被透鏡吸收的光線也越多;另一方面由于視場(指的是所能看到被檢標(biāo)本的范圍)的亮度與放大倍數(shù)的平方成反比,即放大倍數(shù)越高,視場越暗。為了得到足夠的亮度,必須安裝聚光器,把光線集中到所要觀察的標(biāo)本上。
②、觀察時(shí)聚光器應(yīng)處的高度
觀察時(shí),要保證得到zui好的觀察效果,聚光器的聚光焦點(diǎn)應(yīng)正好落在標(biāo)本上。要實(shí)現(xiàn)這個(gè)條件,就必須調(diào)節(jié)聚光器的高度。當(dāng)用平行光照明時(shí),聚光器的聚光焦點(diǎn)是在它上端透鏡平面中心上方約1.25mm之處,因此,人們常常要求在觀察時(shí)將聚光器上升到它上端透鏡平面僅稍稍低于載物臺平面的高度,這樣聚光焦點(diǎn)就可能落到位于標(biāo)準(zhǔn)厚度載玻片上的標(biāo)本上。當(dāng)使用比標(biāo)準(zhǔn)厚度薄的載玻片來承放標(biāo)本時(shí),聚光器的位置要相應(yīng)地降低一些,而當(dāng)使用過厚地載玻片時(shí),聚光焦點(diǎn)只能落在標(biāo)本下方,不利于精細(xì)的觀察。
③、聚光器與物鏡的配合
這里所謂的配合,就是使聚光器和物鏡這兩者的數(shù)值孔徑取得一致,以更好的進(jìn)行較為精細(xì)的觀察。假如聚光器的數(shù)值孔徑低于物鏡,那物鏡的部分?jǐn)?shù)值孔徑就浪費(fèi)了,從而達(dá)不到它的zui高分辨力。假如把聚光器的數(shù)值孔徑大于物鏡的數(shù)值孔徑,則一方面不能提高物鏡的規(guī)定分辨力,另一方面反會(huì)由于照明光束過寬,使物象的清晰度下降。聚光器與物鏡配合的操作方法是:在完成照明、調(diào)焦操作后,取下目鏡直接向鏡筒中看,把聚光器下的可變光闌關(guān)到zui小,再慢慢地開大。開到它的口徑與所見視場的直徑恰好一樣大,然后按上目鏡,即可進(jìn)行觀察。每轉(zhuǎn)換一次物鏡,都要隨著進(jìn)行依次這樣的配合操作。有的聚光器可變光闌的邊框上刻有表示開啟口徑的尺度,可以根據(jù)刻度來進(jìn)行配合。
歷史上顯微鏡的發(fā)明和顯微鏡的每一次創(chuàng)新都給人類的認(rèn)知帶來了飛躍式的發(fā)展;給人類的生活帶來了的拓展。在提倡科技創(chuàng)新的今天,顯微鏡的使用已經(jīng)成為中學(xué)生的一項(xiàng)基本技能,掌握結(jié)構(gòu),科學(xué)使用,良好維護(hù),使之成為廣大青少年探索未來世界的一個(gè)窗口。