1.觀察步驟及儀器操作 根據(jù)實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察?;静襟E如下:
(1)開啟儀器電源及光源:一般先開啟顯微鏡和激光器,再啟動計算機,然后啟動操作軟件,設置熒光樣品的激發(fā)光波長,選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube,PMT)檢測器能得到足夠的信號結果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。
(2)設置相應的掃描方式:在目視模式下.調整所用物鏡放大倍數(shù),在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式,調整雙孔針和激光強度參數(shù),即可得到清晰的共聚焦圖像。
(3)獲取圖像:選擇合適的圖像分辨率,將樣品完整掃描后,保存圖像結果即可。
(4)關閉儀器:儀器測定樣品結束后,先關閉激光器部分,計算機仍可繼續(xù)進行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng).則應該在激光器關閉后,待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。
2.獲取三維圖像 激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能,因此,它可以在不損傷細胞的情況下,獲得一系列光學切片圖像。選用“Z-Stack"模式,即可實現(xiàn)此項功能 。其基本步驟是:
?、匍_啟“Z-Stack”選項;
②確定光學切片的位置及層數(shù);
?、蹎印癝tart”,獲得三維圖像。
3.獲取時間序列圖像 共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能,可以自動在實驗者規(guī)定的時間內按照設定的時間間隔獲取圖像。只需設定所需的時間間隔以及所需圖像數(shù)量,開啟“Start T”功能鍵,即可進行實驗?!癟ime-Series"功能大大減輕了實驗者的勞動強度,對于熒光漂白恢復和鈣離子成像等實驗非常實用。