一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br/>
了解細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持,細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化,物質(zhì)運(yùn)輸,能量轉(zhuǎn)換,信息傳遞,基因表達(dá)等起到重要作用。當(dāng)用適當(dāng)濃度的Triton
X-100處理細(xì)胞時(shí),可將細(xì)胞質(zhì)膜中和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)被溶解抽提,但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存,經(jīng)用戊二醛固定,考馬斯亮藍(lán)
R250染色后,可在光學(xué)顯微鏡下觀察到由微絲組成的微絲束為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),就是細(xì)胞骨架。
三、實(shí)驗(yàn)器材、藥品
材料:洋蔥鱗莖。
器材:普通光學(xué)顯微鏡、滴瓶、容量瓶、試劑瓶、燒杯、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙。
藥品:
(1)M緩沖液(加水定容到1000ml)
試劑名稱 | 終濃度 | 每升加量 |
咪唑 | 50mmol/L | 3.4g |
氯化鉀 | 50mmol/L | 3.73g |
氯化鎂 | 0.5mmol/L | 0.1g |
EGTA | 1mmol/L | 0.38g |
EDTA | 0.1mmol/L | 0.04g |
巰基乙醇 | 1mmol/L | 70ul |
甘油 | 4.0mol/L | 294.8ml |
(2)磷酸緩沖液(pH 6.8):0.2 mol/L 磷酸緩沖液,用NaHCO3調(diào)至 pH6.8。
(3)1%Trion X-100:用M緩沖液配制.
(4)0.2%考馬斯亮藍(lán)R250:其溶劑為甲醇46.5ml,冰醋酸7ml,蒸餾水46.5ml。
(5)3%戊二醛:用0.2 mol/L磷酸緩沖液配。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1.取洋蔥鱗莖切成大小約0.5cm2的塊狀,置磷酸緩沖液內(nèi)浸泡3-10小時(shí);
2.將浸泡后的鱗莖小塊移動(dòng)到1%的Trion X-100中處理30min;
3.用M-緩沖液洗3次,每次5分鐘;
4.放入3%戊二醛中固定30分鐘;
5.磷酸緩沖液洗3次,每次2min;
6.考馬斯亮藍(lán)染色30分鐘;
7.水洗、鋪展、裝片、鏡檢。