熒光壽命是熒光分子在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間,這個(gè)時(shí)間可以反映熒光分子的內(nèi)在屬性和所處的微環(huán)境,是一個(gè)很有用的工具。以往,熒光壽命的測量和計(jì)算是件非常復(fù)雜和耗時(shí)的工作,只有少數(shù)專業(yè)的科學(xué)家關(guān)注和使用該工具。*近幾年,隨著新技術(shù)的發(fā)展,熒光壽命數(shù)據(jù)的獲得越來越容易,也被更多的生命科學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家來利用熒光壽命進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)德國馬普醫(yī)學(xué)研究所的Kai Johnsson研究組長期致力于開發(fā)新的蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù),近期,他們利用熒光壽命來輔助開發(fā)新的蛋白標(biāo)記,在2021年4月在BioRxiv上刊發(fā)了題為“
HaloTag9: an engineered protein tag to improve fluorophore performance"的研究論文。
俗話說巧婦難為無米之炊,科學(xué)實(shí)驗(yàn)第Y步就是拿到好的材料。作者鎖定了常用的標(biāo)簽蛋白Halo7,將其改造成了壽命更長的Halo9。
Halo9的前世今生:
Halo7標(biāo)簽蛋白由于其分子量小、易于表達(dá)、無生物毒性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中。將Halo7標(biāo)簽蛋白與目的蛋白重組后,用帶有氯代烷烴的熒光配基與Halo蛋白發(fā)生脫鹵素反應(yīng)形成酰胺鍵共價(jià)結(jié)合,即可實(shí)現(xiàn)熒光配基對目的蛋白的標(biāo)記(圖1A和1B)。
該實(shí)驗(yàn)室用點(diǎn)飽和突變的方式對Halo7進(jìn)行了改造,篩選得到的Halo9與熒光配基MaP618結(jié)合后,熒光強(qiáng)度較Halo7增加了近百分之四十。更為重要的是熒光壽命發(fā)生了改變,從3.1ns(HaloTag7-MaP618)提升到3.7ns(HaloTag9-MaP618)(圖1D)。
作者構(gòu)建了H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達(dá)細(xì)胞系,使用MaP555-CA來同時(shí)標(biāo)記HaloTag7與HaloTag9,用MaP555-Actin來標(biāo)記F-actin, 而MaP555-Actin與MaP555光譜相同,所以系統(tǒng)僅采用一個(gè)光譜通道完成圖像采集,再通過Phasor根據(jù)熒光壽命拆分出三個(gè)通道,分別是MaP555-CA-H2B-HaloTag7標(biāo)記的細(xì)胞核、MaP555-CA-Tommo20-HaloTag9標(biāo)記的線粒體和MaP555-Actin標(biāo)記的細(xì)胞骨架(圖2)。
這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)勢在哪里呢?傳統(tǒng)的多色成像實(shí)驗(yàn)根據(jù)光譜差異來設(shè)計(jì),會有串色等限制,而且需要多次采集圖像,會造成樣品的光損傷。通過熒光壽命來進(jìn)行成像,僅需要拍攝一次就完成圖像采集,不僅減少了成像時(shí)間,而且降低了激光對樣品的損傷。
綠色,H2B-Halo7標(biāo)記細(xì)胞核;紫色,Tomm20-Halo9標(biāo)記線粒體;藍(lán)色,MaP555-Actin標(biāo)記微絲。Halo7與Halo9配基均為MaP555-CA。Ex:550,Em:570-620。
花樣二:利用熒光壽命進(jìn)行超高分辨成像——TauSTED
H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功后,作者對該細(xì)胞做了STED超高分辨成像。由于只用了一個(gè)染料MaP555去同時(shí)標(biāo)記HaloTag7與HaloTag9, STED成像時(shí)僅需要一次depletion過程就完成圖像采集。后期通過Phasor云圖將H2B和Tomm20的未受受激輻射的長壽命的光子分離出來,即得到背景更純凈的雙色STED圖像(圖3)。
第Y行,共聚焦成像結(jié)果;第ER行,TauSTED成像結(jié)果;第三行 ,共聚焦與TauSTED成像Phasor圖對比。綠色,H2B-Halo7標(biāo)記細(xì)胞核;紫色,Tomm20-Halo9標(biāo)記線粒體,配基均為MaP618-CA。Ex:615,Em:630-760。
技術(shù)盤點(diǎn)——TauSTED
STED技術(shù)通過一束環(huán)形的STED激光來干涉熒光衍射環(huán)的外圈發(fā)生受激輻射從而產(chǎn)生擦除效果,從而突破衍射J限實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像。TauSTED技術(shù)創(chuàng)造性地將STED與熒光壽命技術(shù)結(jié)合,XY分辨率可達(dá)到30nm,獲得高分辨率的同時(shí)可顯著降低STED激光強(qiáng)度保護(hù)樣本。TauSTED特別適合應(yīng)用于組織和細(xì)胞內(nèi)微小結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的觀察,如膜蛋白與膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞器內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、蛋白復(fù)合物等。
從左往右,傳統(tǒng)共聚焦成像,2%STED激光強(qiáng)度傳統(tǒng)STED成像,2%STED激光強(qiáng)度TauSTED成像。
花樣三:利用熒光壽命技術(shù)改造Biosensor
Fucci(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)是一種監(jiān)測細(xì)胞周期的biosensor。Fucci(CA) 將細(xì)胞周期依賴性的降解片段hCdt與hGem分別連接綠色和紅色熒光蛋白,根據(jù)得到的兩種熒光蛋白的強(qiáng)度比例來區(qū)分四種不同的細(xì)胞周期G1期、S期、G2期和M期。作者將此biosensor中的兩種熒光蛋白分別用HaloTag7和HaloTag9進(jìn)行置換,根據(jù)此兩種Tag熒光壽命的不同來指示細(xì)胞周期,構(gòu)建了基于熒光壽命成像的Fucci(CA) -LT。
作者使用TauSense工具測得HT7-hGem的AAT(Average photon arrival time,平均光子到達(dá)時(shí)間)較短,用于指示S期,HT9-hCdt的AAT較長,用于指示G1期,而G2和M期混雜了兩種成分,測得的AAT處于中間水平(圖5A)。由于HaloTag可以用不同的染料進(jìn)行標(biāo)記,Fucci(CA)-LT構(gòu)建成功之后,實(shí)驗(yàn)人員可以任意更換與HaloTag搭配的不同顏色的探針,靈活性更強(qiáng)。此外,作者還將TauSense測得的圖與FastFLIM測得的圖進(jìn)行了對比(圖5B),結(jié)果顯示兩種測量方法的一致性很高。對比基于光譜的Fucci(CA),基于熒光壽命的Fucci(CA)-LT只需要一個(gè)成像通道就完成實(shí)驗(yàn),光毒性較Fucci(CA)降低了一半,在長時(shí)間活細(xì)胞成像中更具有優(yōu)勢(視頻1)。
A,Fucci(CA)-LT工作原理示意;B,Fucci(CA)-LT 指示細(xì)胞周期,TauContrast與FastFLIM測量結(jié)果對比,無明顯差異。
左圖:普通模式成像;右圖:TauGating成像。紅色:葉綠體;綠色:線粒體;門控窗口:0.3-12ns。
左圖:灰色,NUC Red(細(xì)胞核)和SiR-tubulin(微管);黃色,Act-mNeoGreen(微絲)和MitoTracker Green(線粒體),光譜兩兩串色不可拆分。右圖:藍(lán)色,NUC Red(細(xì)胞核);洋紅色,SiR-tublin(微管);紅色,Act-mNeonGreen(微絲);綠色,MitoTracker Green(線粒體)。
總結(jié)
本論文通過改造HaloTag7得到了壽命更長的HaloTag9,HaloTag7與HaloTag9聯(lián)合使用,僅需要一種染料標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)多色成像。用此種方法進(jìn)行TauSTED成像時(shí),可通過phasor將熒光壽命進(jìn)行拆分,一次depletion過程完成雙色STED成像,減少了光損傷。用此方法構(gòu)建的Fucci(CA)-LT biosensor監(jiān)測細(xì)胞周期,可以自由選擇熒光配基的種類,應(yīng)用更靈活。
科研小靈感:
標(biāo)簽蛋白何其多,biosensor何其多。選取一個(gè)切入點(diǎn),開動腦筋改一改,熒光壽命技術(shù)用起來,說不定就成功了呢?
參考文獻(xiàn)
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【3】Roberti, M. J.
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