熒光顯微鏡相比普通光學(xué)顯微鏡有高特異性、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室必不可少的工具，而使用熒光顯微鏡成像拍照，怕的就是出現(xiàn)高強(qiáng)度的熒光染色背景，因?yàn)檫@會(huì)降低成像信噪比，導(dǎo)致樣品信號(hào)不清晰、細(xì)節(jié)丟失。那么熒光染色背景太強(qiáng)有哪些成因呢？又如何避免呢？

一、環(huán)境光導(dǎo)致的背景熒光

陽(yáng)光是非常大影響的環(huán)境光環(huán)境光導(dǎo)致熒光顯微鏡背景熒光增強(qiáng)是很常見(jiàn)的情況，因?yàn)榄h(huán)境光沒(méi)有經(jīng)過(guò)激發(fā)濾光片的過(guò)濾，所以有可能包含激發(fā)光在內(nèi)的各種波長(zhǎng)光，這可能會(huì)帶來(lái)額外的背景熒光和雜散光。暗室成像可降低背景熒光很多老師會(huì)用暗室成像，或用衣服/遮光罩把熒光顯微鏡遮光來(lái)成像，這對(duì)降低一些背景熒光和雜散光是有意義的，有條件可以參考。

二、透射聚光鏡導(dǎo)致的背景熒光

激發(fā)光照亮了下光源，帶來(lái)背景熒光目前使用的熒光顯微鏡主要是落射熒光顯微鏡，也就是說(shuō)，熒光激發(fā)光從物鏡出來(lái)，照射樣品，然后發(fā)射光回到物鏡成像。由于樣品玻片是透明的，因此激發(fā)光穿過(guò)樣品后還會(huì)進(jìn)入透射光路的聚光鏡，再反射并聚光回樣品上，形成強(qiáng)背景熒光。

倒置熒光顯微鏡我們以升級(jí)熒光觀察的正置顯微鏡和倒置顯微鏡為例，給大家介紹如何解決這個(gè)問(wèn)題。調(diào)整聚光鏡前的背景熒光（目鏡成像）首先是正置熒光顯微鏡，在進(jìn)行調(diào)整前，有非常強(qiáng)的同色背景熒光，導(dǎo)致樣品信號(hào)比較難分辨。聚光鏡有限位要先解鎖首先下調(diào)聚光鏡高度，部分機(jī)子可能有限位裝置，需要先解除限位再下降。把聚光鏡光闌收到小，或把黑卡紙、牛皮紙之類不反光的紙片，插到聚光鏡頂部和載物臺(tái)之間。調(diào)整聚光鏡后的背景熒光（目鏡成像）可以看到背景熒光得到了大幅改善，這個(gè)信噪比足夠后期把背景熒光處理掉了。調(diào)整聚光鏡前的背景熒光（目鏡成像）倒置熒光顯微鏡方面，在進(jìn)行調(diào)整前，有偏紅的背景熒光和雜散光出現(xiàn)，影響成像純凈度。聚光鏡孔徑光闌收到小由于倒置顯微鏡無(wú)法調(diào)節(jié)工作高度，也不方便放置遮光板，因此可以做簡(jiǎn)單的操作，把聚光鏡的孔徑光闌收到小，光闌的葉片會(huì)阻擋發(fā)射光透過(guò)，就避免了額外的背景熒光。調(diào)整聚光鏡后的背景熒光（目鏡成像）孔徑光闌收小之后，偏紅的背景熒光就消失了，樣品信噪比得到了改善。

三、來(lái)自樣品、器皿和介質(zhì)的背景熒光

上述兩種背景熒光，都不會(huì)因?yàn)闃悠芬苿?dòng)而變化，如果樣品移動(dòng)背景熒光也有變動(dòng)，那么問(wèn)題可能就出在樣品、器皿或者介質(zhì)，需要針對(duì)性處理。微管中未結(jié)合的染料比如樣品有未結(jié)合的染料，需測(cè)試優(yōu)化合適的熒光染料濃度，并在樣品處理時(shí)使用PBS多漂洗幾次，去除未結(jié)合的染料。熒光染料和植物自發(fā)熒光一同激發(fā)如果樣品有自發(fā)熒光造成干擾，可能需要嘗試其他通道的染料進(jìn)行標(biāo)記，另外塑料器皿也可能有背景熒光，建議使用無(wú)熒光的玻璃器皿。觀察多孔板，塑料有背景熒光如果使用多孔板，可以設(shè)置一些不帶樣品的對(duì)照孔來(lái)獲取背景熒光強(qiáng)度信息，方便后期處理時(shí)可以把背景熒光扣除掉。

免疫熒光標(biāo)記的固定細(xì)胞成像，如果出現(xiàn)背景熒光問(wèn)題，需要檢查封片劑，高倍觀察的話還要注意鏡油是否為無(wú)熒光鏡油。

好了，以上就是本期對(duì)熒光顯微鏡成像背景熒光強(qiáng)的成因和一些解決方法的介紹，希望對(duì)大家的日常實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室管理有幫助。