在顯微鏡學(xué)中,‘分辨率’一詞用于闡述顯微鏡對細(xì)節(jié)進(jìn)行區(qū)分的能力。換言之,這是樣本內(nèi)兩個能被觀察人員或者顯微鏡攝像頭區(qū)分的實(shí)體點(diǎn)之間的理想的距離。
顯微鏡的分辨率本質(zhì)上與光學(xué)元件的數(shù)值孔徑(NA)以及用于觀察樣本標(biāo)本的光波長有關(guān)。此外,我們要考慮Ernst Abbe于1873年提出的衍射J限。
本文章包含了這些概念的歷史介紹并使用相對簡單的術(shù)語對其進(jìn)行了解釋。
分辨率與數(shù)值孔徑
數(shù)值孔徑(NA)與光通過的介質(zhì)的折射率(n)以及給定物鏡的孔徑角(α)有關(guān)(NA=n × sin α)。顯微鏡的分辨率不僅取決于物鏡的NA,還取決于整個系統(tǒng)的NA,要把顯微鏡聚光鏡的NA也納入考慮。在顯微鏡系統(tǒng)中,所有光學(xué)元件都正確對齊、具有相對較高的NA值并且相互協(xié)調(diào)工作,可以分辨出更多的圖像細(xì)節(jié)。分辨率還與標(biāo)本成像所用的光波長有關(guān);波長越短,可分辨的細(xì)節(jié)越多,波長越長則分辨細(xì)節(jié)越少。
在處理分辨率時需要考慮三個數(shù)學(xué)概念:‘阿貝衍射J限’、‘艾里斑’和‘瑞利判據(jù)’。以下按時間順序逐一介紹。
George Biddell Airy與‘艾里斑’(1835)
George Biddell Airy(1801-1892)是英國數(shù)學(xué)家和天文學(xué)家。1826年,25歲的他被任命為三一學(xué)院的數(shù)學(xué)教授,兩年后,被任命為新劍橋天文臺的天文學(xué)教授。1835年到1881年期間,他是“**天文學(xué)家”,月球和火星上各有一處以他的名字命名的隕石坑。
1835年,他在劍橋哲學(xué)學(xué)會學(xué)報(bào)上發(fā)表了一篇題為《有關(guān)圓孔徑物鏡的衍射》的論文。Airy在論文中以一個天文學(xué)家的視角描述了通過一個精良的望遠(yuǎn)鏡觀察到的恒星周圍的光環(huán)或者射線的形狀及亮度。盡管是從不同的科學(xué)領(lǐng)域發(fā)表的文章,但這些觀察結(jié)果與其他光學(xué)系統(tǒng),特別是顯微鏡存在著關(guān)聯(lián)。
艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系統(tǒng)中由圓形孔徑形成的聚焦的光點(diǎn)。如圖1所示,其呈現(xiàn)為中央亮點(diǎn)和周圍是明暗相間的同心環(huán)(更準(zhǔn)確地說,這是艾里圖案Airy pattern)。
衍射圖案由光的波長和光所通過的孔徑大小決定。艾里斑的中心點(diǎn)含有大約84%的光強(qiáng),其余16%分布于環(huán)繞該點(diǎn)的衍射圖案中。當(dāng)然,用顯微鏡進(jìn)行觀察時標(biāo)本上會有許多光點(diǎn),因此基于大量的艾里圖案來考慮,而非如“艾里斑”描述的單個光點(diǎn)來考慮是更妥當(dāng)?shù)姆绞健?/span>
Ernst Abbe與‘Abbe衍射J限’(1873)
Ernst Karl Abbe(1840-1905)是一位德國數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家。他與Carl Zeiss共同創(chuàng)立了“蔡司光學(xué)工作室”即現(xiàn)在的蔡司公司。除此之外,他還在1884年聯(lián)合創(chuàng)辦了Schott Glassworks。Abbe還是定義數(shù)值孔徑這一術(shù)語的首位學(xué)者。1873年,Abbe發(fā)表了自己的理論和公式對顯微鏡的衍射J限進(jìn)行了解釋。Abbe發(fā)現(xiàn),標(biāo)本圖像由許多重疊的、多強(qiáng)度且存在衍射J限的點(diǎn)(或艾里斑)所組成。
要提高分辨率(d=λ/2 NA),標(biāo)本要使用波長(λ)更短的光來進(jìn)行觀察,或者通過折射率相對高的成像介質(zhì)來進(jìn)行觀察,又或者使用NA較高的光學(xué)組件來進(jìn)行觀察(或者將全部3種因素組合起來)。
但即便將所有這些因素都考慮在內(nèi),顯微鏡系統(tǒng)的J限依然受到限制,因?yàn)橄到y(tǒng)復(fù)雜性,波長低于400 nm的光在玻璃中的傳播特征,以及整套顯微鏡需要達(dá)到較高的NA。理想光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率限制在200 nm左右,而軸向分辨率約為500 nm(有關(guān)分辨率J限示例,請參見下文)。
John William Strutt與‘瑞利判據(jù)’(1896)
第三代瑞利男爵John William Strutt(1842-1919)是一名英國物理學(xué)家,也是一位高產(chǎn)學(xué)者。他一生編寫了多達(dá)466篇論文,包括430 篇科研論文。他的論文涉獵J廣,各種主題都有,如鳥類飛行、心理研究、聲學(xué)等等。1895年,他發(fā)現(xiàn)了氬并憑借這一發(fā)現(xiàn)于1904年獲得諾貝爾獎。
Rayleigh以George Airy的理論為基礎(chǔ)上并進(jìn)一步延伸,于1896年創(chuàng)造了“瑞利判據(jù)”理論(Rayleigh Criterion)。瑞利判據(jù)在衍射J限系統(tǒng)當(dāng)中定義了分辨率J限,換言之,就是何時能夠?qū)?/span>2個光點(diǎn)相互區(qū)分或分辨。
使用艾里斑理論,如果2個單獨(dú)艾里斑的衍射圖案不重疊,則就可以輕松區(qū)分、‘分辨’兩者并認(rèn)定滿足瑞利判據(jù)。而當(dāng)艾里斑的中心直接重疊于另一個艾里斑的理想衍射圖案時,則兩者認(rèn)定為‘剛好分辨’,同時依然可以區(qū)分為2個獨(dú)立的光點(diǎn)。如果艾里斑再繼續(xù)相互接近,則兩者無法滿足瑞利判據(jù),因此“無法被分辨”為2個不同的光點(diǎn)(或者標(biāo)本圖像中的單獨(dú)細(xì)節(jié))。
如何計(jì)算顯微鏡的分辨率
將以上全部理論都考慮在內(nèi)就可以明顯看出,在計(jì)算分辨率的理論J限時需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質(zhì)。我們來看一下使用阿貝衍射J限以及使用瑞利判據(jù)進(jìn)行的分辨率計(jì)算。
先應(yīng)當(dāng)要牢記:
NA= n x sin α
式中n為成像介質(zhì)的折射率,α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的理想的孔徑角大約為144o。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52,則物鏡的理想的NA為1.45。如果使用‘干式’(無浸沒)物鏡,則物鏡理想的NA為0.95(因?yàn)榭諝獾恼凵渎蕿?.0)。
橫向(即XY)分辨率的阿貝衍射公式為:
d= λ/2 NA
式中λ 是標(biāo)本成像所用的光波長。如果使用514 nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡,則分辨率的(理論)J限將達(dá)到177 nm。
軸向(即Z)分辨率的阿貝衍射公式為:
d= 2 λ/NA2
同樣的,如果我們假設(shè)通過波長514 nm的光來觀察標(biāo)本且物鏡NA數(shù)值為1.45,則軸向分辨率為488 nm。
在阿貝衍射J限的基礎(chǔ)上,瑞利判據(jù)稍稍得到了細(xì)化:
R= 1.22 λ/NAobj+NAcond
式中λ為標(biāo)本成像用的光波長。NAobj 為物鏡NA。NAcond為聚光鏡NA。‘1.22’是一個常系數(shù)。該數(shù)值根據(jù)Rayleigh的貝塞爾函數(shù)研究推導(dǎo)得出。這些主要用于對系統(tǒng)當(dāng)中的問題,例如波的傳遞,進(jìn)行計(jì)算。
將聚光鏡的NA考慮在內(nèi),空氣(折射率為1.0)通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的孔徑角為144o,則NAcond數(shù)值將等于0.95。
如果使用514 nm的綠光,油浸物鏡的NA為1.45,聚光鏡的NA為0.95,則分辨率的(理論)J限將達(dá)到261 nm。