細胞培養(yǎng)操作中，細胞計數(shù)是不可或缺的操作，那樣細胞計數(shù)該怎么操作呢？

1，Z先備好細胞計數(shù)器(血球計數(shù)板)

應(yīng)用70%酒精將蓋玻片和細胞計數(shù)板清理、晾曬預(yù)留。

將曬干的蓋玻片輕輕地遮蓋至血細胞計數(shù)機中。

(注：使用時須確保蓋玻片和計數(shù)板已充足晾曬，否則就會危害后面細胞充池及計數(shù)結(jié)論。)

2，制取細胞懸浮液

針對貼壁生長細胞，我們應(yīng)該Z先應(yīng)用胰酶消化方式使細胞從細胞培養(yǎng)皿表層掉下來。(飄浮細胞也無需消化吸收，稀釋液到適宜倍率就可以。)

然后加入適度的含血清蛋白培養(yǎng)液，中合胰水解作用并舉懸細胞，以獲得勻質(zhì)的細胞懸浮液。規(guī)定盡量將細胞飄散，不必殘余一切細胞團，但不能用勁太大。

(注：消化吸收過于或消化吸收不完整均會讓計數(shù)結(jié)論造成誤差。)

臺盼蘭染色(可選擇)：

必要時測算細胞的活動力，就需要將細胞懸浮液和0.4%臺盼蘭等體積混合;

室內(nèi)溫度孵化3-5min(飄浮細胞染色時長可視性狀況適當增加)，使臺盼蘭徹底進到死細胞，使死細胞著深藍色。

3，血細胞計數(shù)器加樣

應(yīng)用塑料吸管或加樣器將細胞懸浮液或細胞/臺盼蘭混合物滴入到計數(shù)池邊沿。這時液體將于虹吸式的影響下進到蓋玻片下方計數(shù)池，此即是充池。

(注：如要開展好幾個樣品計數(shù)，應(yīng)盡量保持每一次充池容積一致，一般在10μl/池上下。)

用同樣的方式為另一側(cè)的計數(shù)池里也加入了計數(shù)試品。

將計數(shù)板靜放數(shù)分鐘使細胞蔓延、地基沉降。

4，細胞計數(shù)

在100倍高倍顯微鏡，挪動計數(shù)板將視線指向計數(shù)板中間大方塊，該格子四周有一圈3條直線包圍著，中間是集中的網(wǎng)格圖。中間格子區(qū)類似正好可以鋪滿全部視線(下面的圖標識的3號部位)。

各自計數(shù)大方格1.2.4.5里的細胞數(shù)。(為了降低計數(shù)偏差，Z好把細胞濃度值調(diào)整至20-50個/大方格。)并重復(fù)記錄另一側(cè)計數(shù)池里的細胞數(shù)，累計8個大方塊，隨后取平均值。

計數(shù)標準為：“數(shù)中不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”。(判定標準為是不是觸碰三條邊框線的分隔線)

假如有好幾個細胞并沒有飄散而結(jié)團存有，這時只能記作一個細胞。假如包塊許多，則需要再次吹打乃至再次抽樣消化吸收直到絕大部分細胞為單獨細胞。

5，細胞濃度值

每一個大方格的容量為：

1 mm2×0.1 mm=0.1 mm3=10-4 cm3=10-4 ml

即每一個大方格的容量為萬分之一mL，因而在預(yù)估每毫升液態(tài)里的細胞數(shù)時要乘于104。

在普通未使用臺盼蘭染色時，可以通過下邊公式換算每毫升樣本中細胞的數(shù)量：

每毫升樣本中細胞的數(shù)量=每一個大方格內(nèi)細胞的平均值 × 細胞稀釋倍數(shù)×104

如果采用了臺盼蘭染色，還要測算活細胞的百分比：

活細胞百分比(%)=臺盼蘭拒染細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100

這時活細胞數(shù)字的計算公式：

每毫升樣本中活細胞的數(shù)量=每一個大方格中細胞的平均值×活細胞比例×細胞稀釋倍數(shù)×2×104

注：乘2主要是因為在臺盼蘭染色時，展開了等體積混合，等同于稀釋液了一倍。

看過之**程和機理，大伙兒禁不住要問：為什么一定要數(shù)細胞啊?細胞計數(shù)到底有哪些作用呢?實際上，在我們想知道細胞生長狀況時，除開立即觀查細胞形狀之外，制作細胞生長曲線圖、測算細胞增長時長當然就是廣泛采用的評價指標體系了。

所以雖然應(yīng)用血細胞計數(shù)板手工制作計數(shù)細胞全過程十分繁雜，對試驗者操作者規(guī)定也非常嚴格，現(xiàn)在都已經(jīng)有許多自動化細胞計數(shù)器/儀，但是對于科研中所遇到的細胞來講，手工制作計數(shù)依然是很簡單易行的辦法所以被眾多試驗室選用。